基礎研究
mTOR抑制劑對癲癇大鼠免疫微環境的影響
謝撲松 何金水 周火旺
【摘要】 目的 探討mTOR抑制劑對癲癇大鼠血液和腦組織免疫微環境的影響。方法 選用40只癲癇大鼠，隨機分為4組，每組10只，空白對照組（生理鹽水干預），不同劑量mTOR抑制劑（雷帕霉素）干預組：低劑量組[1 mg/（kg?d）]，中劑量組[2 mg/（kg?d）] ，高劑量組[4 mg/（kg?d）]。分別進行為期8周的干預，8周后處死大鼠，保留大鼠血清及腦組織樣本。經ELISA法檢測大鼠血清IL-2、IL-10和IFN-γ水平。經流式細胞技術檢測大鼠腦組織的T細胞亞群。
【關鍵字】 癲癇,mTOR抑制劑,大鼠,免疫微環境
中圖分類號：文獻標識碼：文章編號：
Objective To determine the influence of rapamycin intervention on epileptic rats blood and the brain tissue immune microenvironment. Methods A total of 40 epileptic rats were used in the study and randomly divided into 4 groups (n=10). The blank control group with normal saline intervention, and with different doses of rapamycin: low-dose group [1 mg/（kg?d）], medium-dose group [2 mg/（kg?d）], high-dose group [4 mg/（kg?d）]. Rats in the four groups went through intervention for 8 weeks. After 8 weeks, the rats were sacrificed, rat serum and brain tissue samples were reserved. The ELISA method was used to test peripheral blood (PB), IL-2, IFN-γ and IL-10 levels. Flow cytometry was used to test the state of T-cell subsets.
癲癇是神經系統常見疾病之一，癲癇的發作給患者造成巨大的生理和心理創傷，同時給患者帶來沉重的經濟負擔。癲癇的發病機制目前尚未完全明確。有研究表明，癲癇的發生與膠質細胞增生、神經元凋亡、免疫炎性反應以及異常通路形成密切相關[1]。有研究證實，大腦的炎性反應和免疫損傷在癲癇發生、發展過程中起重要作用[2]。許多研究數據顯示激活mTOR信號通路可在遺傳性和獲得性癲癇所起的重要作用[3]。mTOR作為信號級聯的中央節點影響免疫微環境中各種信號的輸入，調節各種免疫細胞，包括T細胞、B細胞、NK細胞以及APC等細胞的分化發育，并影響其功能活性[4]。雷帕霉素是一種mTOR抑制劑，可通過不同的細胞因子影響信號傳導，從而阻斷T細胞由分化進程，發揮免疫抑制的作用。目前，雷帕霉素干預癲癇模型探討癲癇發病機制的研究甚少。本研究通過建立癲癇大鼠模型，用不同劑量雷帕霉素和生理鹽水干預后，觀察大鼠外周血和腦組織T細胞亞群以及IL-2、IFN-γ和IL-10含量的變化，探討雷帕霉素干預對大鼠血液和腦組織免疫微環境的影響。
1 材料與方法
1.1材料 將8周齡SPF級雄性大鼠進行癲癇建模。研究選用40只建模成功的大鼠，無水氯化鋰（北京索萊寶科技有限公司），鹽酸毛果云香堿（阿拉?。?，雷帕霉素(中國上海源葉生物科技有限公司)、IL-2、IFN-γ和IL-10試劑盒(R&D SYSTEMS)、RAT CD3、RAT CD4、RAT CD25試劑盒（BD），流式細胞儀、離心機和光學顯微鏡。本研究經廈門大學實驗動物管理與倫理委員會批準（倫理批號XMULAC20220008）。
1.2方法 將40只癲癇大鼠隨機分為4組，每組10只，空白對照組（生理鹽水干預），不同劑量mTOR抑制劑（雷帕霉素）干預組：低劑量組[1 mg/（kg?d）]，中劑量組[2 mg/（kg?d）]，高劑量組[4 mg/（kg?d）]。干預8周后頸脫位處死。取全血5 mL，4 ℃離心10 min，血清保持在-20 ℃。經酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測大鼠血清IL-2、IL-10和IFN-γ。取額葉腦組織5 g，用電動勻漿器制成組織勻漿，靜置、離心，取上清液保存-80 ℃冰箱備用。分離單個核細胞經RPMI-1640培養基調整，將其置于24孔板內，每孔1 mL。置于孵箱中孵育培養，將細胞懸于100 μL PBS中，加入標記的CD3、CD4和CD25抗體5 μL，室溫避光反應15 min。用PBS洗滌2次，并將細胞懸于300 μL PBS內進行流式細胞術檢測。
1.3 統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行統計分析。對數據進行正態性檢驗，滿足正態分布，采用單因素ANOVA分析；不滿足正態分布，采用非參數檢驗；P＜0.05表示差異有統計學意義。
2 結 果
2.1 ELISA實驗 每組預計檢測10只，共4組，但在取樣前共有5只大鼠死亡。正常大鼠（未使用生理鹽水或者mTOR抑制劑干預的大鼠）檢測了1只。
2.1.1 IL-2檢測 檢測結果如表1，根據標曲y=0.0008x+0.3329（R2=0.9913）計算得到各組大鼠的IL-2含量。正常大鼠IL-2含量為-27.4 pg/mL。行正態性檢驗發現中劑量組不滿足正態分布，采用非參數檢驗，P＞0.05，IL-2的表達量差異無統計學意義。